KTU mokslininkai kuria sąnario mikroaplinką laboratorijoje: 3D platforma kremzlės ir kaulo sąveikai tirti

Osteoartritas pažeidžia ne tik sąnario kremzlę. Ligos procesai apima ir gilesnius audinius – kalcifikuotą kremzlę bei po ja esantį subchondrinį kaulą. Todėl mokslininkams, siekiantiems geriau suprasti ligos eigą ir vertinti naujas gydymo strategijas, reikia laboratorinių modelių, kurie atkurtų ne vien atskiras ląsteles, bet ir sudėtingą jų mikroaplinką.

Kauno technologijos universiteto Cheminės technologijos fakulteto (KTU CTF) mokslininkai kartu su Valstybinio mokslinių tyrimų instituto Inovatyvios medicinos centro (IMC) tyrėjais projekte MULTICHONDRO sukūrė daugiasluoksnę 3D platformą osteochondrinio audinio tyrimams. Joje derinami gradientinio poringumo polimeriniai karkasai, kremzlės ir kaulo ribą imituojantis nanopluoštinis sluoksnis bei skirtingoms audinio zonoms pritaikyti hidrogeliai.

Vien poringumo nepakanka

3D karkasas ląstelėms yra ne tik mechaninė atrama. Porų dydis, pluoštų storis ir jų kitimas per visą konstrukto gylį lemia, kur ląstelės prisitvirtina, kaip giliai jos patenka ir ar gali tolygiai pasiskirstyti visoje struktūroje.

Tyrėjai pagamino kelis polikaprolaktono (PCL) karkasų variantus, kuriuose porų dydis palaipsniui mažėjo nuo maždaug 112 iki mažiau nei 1 mikrometro. Nors bendras karkasų poringumas siekė apie 90 proc., biologiniai tyrimai parodė, kad vien didelis poringumas savaime neužtikrina tinkamo ląstelių pasiskirstymo. Geriausiai pasirodžiusioje architektūroje žmogaus kremzlės ląstelės – chondrocitai – po aštuonių auginimo dienų buvo pasiskirsčiusios tolygiau per visą karkaso storį, o kituose variantuose jos labiau kaupėsi tankesniuose apatiniuose sluoksniuose.

„Eksperimentiniai rezultatai parodė, kad ląstelių pasiskirstymą lemia ne tik bendras karkaso poringumas, bet ir porų bei pluoštų dydžio kitimas per visą konstrukto storį. Tinkamai suformuotas morfologinis gradientas sudaro sąlygas tolygesniam ląstelių pasiskirstymui karkase“, – sako KTU CTF doktorantė Aistė Pupiūtė.

Šešios audinio zonos viename karkase

Remdamiesi šiais rezultatais mokslininkai sukūrė dar sudėtingesnę struktūrą – vientisą daugiasluoksnį osteochondrinį karkasą. Jame suformuotos šešios zonos, atkartojančios svarbiausius natūralios kremzlės ir po ja esančio audinio struktūrinius skirtumus: paviršinė, vidurinė ir gilioji kremzlės zonos, skiriamoji zona (angl. tidemark), kalcifikuotos kremzlės bei subchondrinio kaulo zona.

Skirtingoms karkaso dalims formuoti buvo derinamos trys pluoštų gamybos technologijos – lydalo ir tirpalo elektroverpimas bei tirpalo pūtimo verpimas. Mineralizuotose zonose panaudotas hidroksiapatitas, padedantis sukurti kaulinę mikroaplinką imituojančią medžiagos sudėtį.

Ypatingą funkciją atlieka tankus nanopluoštinis skiriamasis sluoksnis. Siekdami įvertinti, ar jis gali veikti kaip barjeras tarp dviejų mikroaplinkų, tyrėjai iš skirtingų karkaso pusių pasėjo dvi skirtingai fluorescenciškai pažymėtas ląstelių populiacijas. Po dešimties dienų viena populiacija daugiausia išliko kremzlinėje karkaso dalyje, o kita – mineralizuotoje. Tai parodė, kad suformuotas sluoksnis gali padėti išlaikyti erdvinį skirtingų ląstelių populiacijų atskyrimą.

„Mūsų tikslas buvo sukurti ne dar vieną porėtą karkasą, o valdomą trimatę sistemą, kurioje skirtingos audinio zonos turėtų savo struktūrą ir funkciją. Ypač svarbu, kad kremzlinę ir kaulinę dalis galime fiziškai atskirti, bet kartu išlaikyti galimybę ateityje tirti jų tarpusavio sąveiką“, – teigia projekto vadovas, KTU CTF mokslininkas dr. Edvinas Krugly.

Plazma keičia paviršių, o ne visą karkasą

PCL yra mechaniškai stabilus ir biomedicinoje plačiai naudojamas polimeras, tačiau jo paviršius yra gana hidrofobiškas. Tai nėra palanku ląstelių prisitvirtinimui, todėl mokslininkai karkaso paviršių modifikavo netermine plazma – metodu, leidžiančiu keisti paviršiaus savybes nepažeidžiant visos trimatės struktūros.

Optimizavus procesą, vandens kontaktinis kampas sumažėjo nuo 108 iki maždaug 50 laipsnių, o pluoštų paviršius nanometriniu masteliu tapo šiurkštesnis. Tokie pokyčiai sukuria ląstelėms palankesnį kontaktinį paviršių, išlaikant karkaso geometrinę struktūrą ir mechaninį stabilumą.

Karkasas gali būti ir bioaktyviųjų medžiagų nešiklis

Atskira projekto tyrimų kryptis parodė, kad pluoštinį karkasą galima naudoti ne tik kaip atramą ląstelėms, bet ir kaip bioaktyviųjų medžiagų nešiklį. Kontroliuojama šarminė hidrolizė pakeitė pluoštų paviršiaus chemiją ir leido sumažinti pradinį TGF-β3 augimo faktoriaus išsiskyrimą.

Per pirmąją parą iš modifikuoto karkaso išsiskyrė 30,7 proc. įterpto TGF-β3, palyginti su 39,4 proc. iš nemodifikuoto karkaso, o vėliau augimo faktorius buvo atpalaiduojamas palaipsniui. Tai rodo galimybę derinti karkaso struktūrą ir paviršiaus chemiją taip, kad biologiniai signalai būtų perduodami labiau kontroliuojamu būdu.

Hidrogeliai priartina modelį prie natūralios mikroaplinkos

Paskutiniame platformos kūrimo etape pluoštinis karkasas buvo papildytas metakrilintos hialurono rūgšties (MeHA) hidrogeliais. Kremzlinei karkaso daliai skirtas hidrogelis papildytas chondroitino sulfatu, o mineralizuotai – hidroksiapatitu. Taip viename konstrukte suformuotos dvi skirtingos hidratuotos mikroaplinkos, kurias tarpusavyje skiria nanopluoštinis ribinis sluoksnis.

„Dabar turime ne tik atskirus sėkmingai veikiančius komponentus, bet ir platformą, kurioje galime derinti karkaso morfologiją, paviršiaus savybes, skirtingus hidrogelius ir bioaktyviąsias medžiagas. Kitas svarbus etapas – išsamesnis biologinis sistemos įvertinimas taikant sudėtingesnes ląstelių kultūras ir jos pritaikymas osteoartrito procesams modeliuoti“, – sako dr. E. Krugly.

Kitas žingsnis – biologinis modelio validavimas

Tyrėjai pabrėžia, kad šiame etape sukurta sistema yra išsamiai fizikochemiškai charakterizuota platforma tolesniems biologiniams tyrimams, o ne galutinai validuotas osteochondrinio audinio modelis. Toliau numatoma vertinti sudėtingesnes skirtingų ląstelių kultūras, kremzlės ir kaulo tarpusavio signalizaciją, uždegiminių procesų bei mechaninės apkrovos poveikį.

Tokie kontroliuojami in vitro modeliai gali padėti tiksliau tirti osteoartrito mechanizmus ir ankstyvose tyrimų stadijose vertinti potencialias terapines medžiagas, kartu suteikdami galimybę atskirai analizuoti, kaip į tą patį poveikį reaguoja skirtingos osteochondrinio audinio zonos.

Dalies MULTICHONDRO tyrimų rezultatai paskelbti tarptautiniuose mokslo žurnaluose „Reactive and Functional Polymers“ ir „Results in Chemistry“.

MULTICHONDRO projektą įgyvendina Kauno technologijos universitetas kartu su Valstybiniu mokslinių tyrimų institutu Inovatyvios medicinos centru. Projektą „Naujos kartos osteochondrinio audinio in vitro modelis: sinergetinis daugiasluoksnių 3D polimerinių konstruktų ir išmaniųjų hidrogelių inžinerinis integravimas“ finansuoja Lietuvos mokslo taryba, projekto Nr. S-MIP-24-38.